Digital PCR,绽放正当时!

2018-11-07

dPCR发展历史

1992年,Sykes等从非淋巴细胞和正常体细胞背景中鉴定突变的白血病细胞,检测了复杂背景下低丰度的IgH重链突变基因。该研究中提出了三个重要的原则:有限稀释、终点信号的有或无及对数据泊松分布的统计处理,为以后dPCR的发展奠定了基础。

1997年,有研究利用玻璃毛细管作为载体进行PCR反应,可以对模板分子进行定量,验证了Taq-Man探针可以检测模板单分子,尤其在微小的反应体系中,发展了单分子定量技术,为dPCR单模板扩增提供了技术支持。

1999年,Bert VogelsteinKenneth W. Kinzler正式提出了dPCR的概念,他们在结肠癌患者粪便中检测KRAS基因突变时,首先把样本分配到384孔板中,然后分别用不同荧光检测突变基因和正常基因,通过计算突变基因和正常基因的比例来得出突变率。

2003 Dressman BEAMing 方法(珠子、乳剂、扩增与磁力) BEAMing 将模板、引物、PCR 试剂和磁珠的混合物分至小滴中,其中大多数的小滴不含有或只含有一个模板。PCR 完成后,其中扩增产物会通过生物素——链酶亲和素的键合关联在磁珠上,乳化物随之会被打散,珠子就能通过与检测寡核苷酸和流式细胞仪的杂交物所读取。

2006 Fluidigm公司推出了第一台基于芯片的商品化数字PCR系统。随后,QuantaLife 利用油包水微滴生成技术开发了微滴式数字PCR技术。2011年,QuantaLife 公司被Bio-Rad公司收购,其微滴式数字PCR仪产品更名为QX100型号仪,2013年该公司又推出了升级型号QX2002013年下半年,Life-technologies推出了QuantStudio 3D数字PCR系统。


商业化数字PCR平台的概述

类型

供应商

生产时间

仪器型号

分液数目

特点

芯片式

 

Fluidigm

2006

EP1

36,960

基于集成流体通路芯片,快速准确地将流体分成独立的单元。操作耗时,反应成本高。

2006

BioMark HD

9180

Life Technologi-es

2009

Open Array

3072

反应重复的数量可轻松调整,以满足应用需求。

样品之间完全隔离,防止交叉污染。反应的通量

较低。

2009

QuantStudio 12K   Flex

3072

2013

QuantStudio

3D

20,000

微滴式

Bio-Rad

2011

QC100

20,000

基于油包水技术大量的微滴提供了足够的精确度能准确测定样品拷贝数可同时进行96样本反应

2013

QX200

20,000

RainDance

2012

RainDrop

10,000,000

皮升级反应微滴提供更高的检测动态范围适用于处理更大浓度差异的不同样品

 

基本原理

dPCR的原理是将含有核酸模板的标准PCR反应体系,平均分配成上万个和数百万个PCR 反应,分配到芯片或微滴中,使每个反应中尽可能含有一个模板分子,进行单分子模板PCR反应,利用标记的探针检测特定的靶序列,通过读取荧光信号的有或无,计算两种信号类型的反应单元比例和数目,经过统计学泊松分布的校准进行绝对定量。

                               

在通常情况下,数字PCR的反应单元中可能包含两个或两个以上的目标分子,这时需要采用泊松概率分布公式(Poisson distribution)进行计算

  

上式中λ为每个反应单元中所含目标DNA分子的平均拷贝数(浓度),p为在一定的λ条件下,每个反应单元中所含k个拷贝目标DNA分子的概率。λ由样品的稀释倍数m决定,有λ=cm,其中c为样品的原始拷贝数(浓度) 。当k=0(不含目标DNA 分子) 时上式可简化为p=e=e -cm p可以看作是无荧光信号的反应单元数与反应单元总数的比值,即

 

其中,n为反应单元总数,f 为有荧光信号的反应单元数, 上式两边取对数(ln)得到

根据数字PCR 反应单元总数和有荧光信号的单元数以及样品的稀释倍系数,就可以得到样本的最初拷贝数(浓度)

不同于 qPCR对每个循环进行实时荧光测定的方法,dPCR 技术是在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集,最后根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例得出靶分子的起始拷贝数或浓度。

根据大量独立反应单元实现方式的不同,dPCR又细分为基于液滴式微流控(droplet microfluidics)的微滴数字PCRdroplet digital PCRddPCR)和基于芯片式微流控的微阵列芯片式数字PCRchip digital PCRcdPCR)。


微流控芯片数字PCR

随着微流芯片技术的发展,数字 PCR 借助微流芯片,可以把样本准确并且快速的分成若干个独立的反应单元,各个单元之间互不影响,可以多步反应同时进行。提高反应通量的同时也降低了反应消耗成本。目前Fluidigm公司的Bio-Mark TM 基因分析系统,Life Technologies公司QuantStudio TM 3D数字 PCR系统均均为采用微流控芯片技术的数字PCR系统。

                  

 

液滴数字PCR

数字PCR源于乳液PCR(emulsion PCR)技术 ,利用微滴发生器可以一次生成数万乃至数百万个纳升甚至皮升级别的单个油包水微滴,作为数字PCR的样品分散载体,PCR反应结束后检测每个微滴的荧光信号。目前Bio-Rad公司的QX100系统、 QX200系统均为采用液滴技术的数字PCR系统。

                

          


数字PCR与实时荧光定量PCR的比较

方法

原理

应用

优点

缺点

数字PCR

PCR反应体系进行分液,PCR扩增,通过统计阳性反应和阴性反应的数目,直接得出样品的拷贝数

病毒载量的绝对定量;拷贝数变异分析;罕见突变的检测;基因表达定量;二代测序文库分析等

绝对定量,不需要标准曲线,灵敏度高,对PCR反应抑制剂的耐受能力更

检测的动态范围要小,容易产生假阳性,成本较高

实时荧光定量PCR

扩增产物的量与荧光信号强度成正比,通过反应的循环阈值及标准曲线,对样品定量

病原体的检测与定量;基因表达的相对检测;单核苷酸多态性分析;肿瘤标志物的检测等

检测的动态范围广,应用范围广,成本较低

扩增效率易受PCR反应抑制剂的影响

 

应用

dPCR技术具有以下的优势:

(1)高灵敏度。dPCR本质上将一个传统的PCR反应变成了数万个PCR反应,在这数万个反应单元中分别独立检测目的序列,从而大大提高了检测的灵敏度。

(2)高精确度。dPCR通过计算在数万个反应单元中阳性反应单元数量和比例,可以精确地检测出变化很小的目的序列差异。

(3)高耐受性。dPCR技术第一步反应体系分配的过程,可以使背景序列和PCR反应抑制物被均匀分配到每个反应单元,而大部分反应单元中并不含有目的序列,低丰度的目的序列被相对富集于某些反应单元中,从而显著地降低了这些反应单元中背景序列和抑制物对反应的干扰。另外,dPCR在对每个反应单元进行结果判读时仅判断阳性/阴性两种状态,不依赖于Ct值,受扩增效率的影响大为降低,对背景序列和抑制物的耐受能力也大大提高。

 (4)绝对定量。PCR直接计算目的序列的拷贝数,无需依赖于Ct值和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测。

dPCR的以上优点使其特别适合于以下方面的应用:

领域

应用实例

临床诊断

无创产前诊断

癌症标志物检测

病毒检测

拷贝数变异分析

稀有突变检测

基因表达分析

复杂样品基因表达分析

单细胞基因表达分析

下一代测序

测序结果验证

测序文库质控

基因成分定量

转基因成分分析

         微生物检测

               水样微生物检测

               病原微生物检测

 

dPCR作为核酸定量的新技术,与此前的核酸定量方法相比,方法的灵敏度、准确度更高。dPCR为分子生物学、微生物学等领域提供了新的检测方法和实验思路。从应用的范围、实验的成本角度来看,dPCR不可能完全取代qPCR,但是dPCR方法可以进行精准的绝对定量分析,极好的数据重现性,而且样本需求较低,在核酸检测与定量等方面有非常重要的补充。在整个dPCR的发展过程中,应用越来越广泛,在核酸检测定量、抗病毒治疗监测、预后判断具有重要的意义。随着dPCR技术和商品化平台的发展,dPCR的通量将会更高,成本更低,在科学研究领域将会发挥更重要的作用。

 

参考文献


  1. 殷海月,数字PCR,东华大学.

  2. 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所,关于“数字 PCR 发展、原理、运用和前景”调查汇报,2017.3.

  3. 詹成,燕丽等.数字PCR技术的发展和应用[J].复旦学报(医学版),2015 Nov., 42(6).

  4. 冯兆民,舒跃龙. 数字PCR技术及其应用进展[J]. 病毒学报 Vol. 33 No. 1 January 2017.

  5. 林彩琴,姚波.数字PCR技术进展[J].化工进展,2012 Dec., 24(12).

  6. Jeffrey M. Perkel;高大海,姜天海译. 数字PCR革命,英文原文由美国科学促进会发布在2014 411日《科学》杂志.


 

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